對微生物菌種的新發(fā)現(xiàn)

微生物工業(yè)自從采用純種發(fā)酵以來，產(chǎn)率有了很大的提高，然而防止雜菌污染的要求也更高了。人們在與雜菌污染的斗爭中，積累總結(jié)出很多寶貴的經(jīng)驗(yàn)。規(guī)范了管理措施，設(shè)計(jì)了一系列設(shè)備(例如密閉式發(fā)酵罐，培養(yǎng)基滅菌設(shè)備，無菌空氣制備設(shè)備等)和管道，應(yīng)用了無菌室甚至無菌車間，建立了無菌操作技術(shù)，因而大大降低了發(fā)酵染菌率。但是某些發(fā)酵工業(yè)還遭受著染菌的威脅，染菌后輕者影響產(chǎn)率、產(chǎn)物提取收得率和產(chǎn)品質(zhì)量，重者造成“倒罐” ，不但浪費(fèi)大量原材料，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，還會對周圍環(huán)境造成破壞。凡是在發(fā)酵液或發(fā)酵容器中侵入了非接種的微生物統(tǒng)稱為雜菌污染，及早發(fā)現(xiàn)雜菌并采取相應(yīng)措施，對減少由雜菌污染造成的損失至關(guān)重要。

現(xiàn)代工業(yè)的生物試劑規(guī)模越來越大，每只發(fā)酵罐的容積有幾十甚至幾百立方米。因此要在短時間內(nèi)完成發(fā)酵，必須要有數(shù)量巨大的微生物細(xì)胞才行。種子擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)就是要獲得數(shù)量足夠的健壯的微生物。種子擴(kuò)大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生物試劑菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴(kuò)大培養(yǎng),終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。



因此檢查的方法要求準(zhǔn)確、快速。發(fā)酵污染可發(fā)生在各個時期。種子培養(yǎng)期染菌的危害大，因嚴(yán)格防止。一旦發(fā)現(xiàn)種子染菌，均應(yīng)滅菌后棄去，并對種子罐及其管道進(jìn)行*滅菌。發(fā)酵前期養(yǎng)分豐富，容易染菌，此時養(yǎng)分消耗不多，應(yīng)將發(fā)酵液補(bǔ)足必要養(yǎng)分后迅速滅菌，并重新接種發(fā)酵。發(fā)酵中期染菌不但嚴(yán)重干擾生物試劑菌株的代謝，而且會影響產(chǎn)物的生成，甚至使已形成的產(chǎn)物分解。



由于發(fā)酵中期養(yǎng)分已被大量消耗，代謝產(chǎn)物的生成又不是很多，挽救處理比較困難，可考慮加入適量的抗生素或殺菌劑。如果是發(fā)酵后期染菌，此時產(chǎn)物積累已較多，糖等養(yǎng)分已接近耗盡，若染菌不嚴(yán)重，可繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵;若污染嚴(yán)重，可提錢放罐。染菌程度越重，危害越大;染菌少，對發(fā)酵的影響就小。所以，實(shí)際生物試劑中，應(yīng)當(dāng)根據(jù)污染程度和發(fā)酵時期區(qū)別對待。



一、實(shí)驗(yàn)方法



1.種子的擴(kuò)大培養(yǎng)



①斜面培養(yǎng)基的配制

配制營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，分裝，滅菌(121℃條件下滅菌 30min)，倒斜面。



②菌種的活化

⑴將大腸桿菌采用無菌操作的方法接種于斜面上，37℃下培養(yǎng)18h;

⑵培養(yǎng)18h后，觀察菌落顏色是否一致，若均為黃色，挑取培養(yǎng)皿周邊的菌落進(jìn)行無菌檢測;若顏色有黃有白，則兩種顏色的菌落均要進(jìn)行無菌檢測。檢測方法常用染色鏡檢，若檢測后，沒有污染，便可進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng);若檢測到雜菌，要重復(fù)上述步驟，直到無菌為止，否則，不能繼續(xù)下一步操作。



③擴(kuò)大培養(yǎng)

在無菌條件下，從檢測后的活化培養(yǎng)基上挑取10個左右菌落，用接種針接種到擴(kuò)大培養(yǎng)基(即種子培養(yǎng)基)中，于37℃下振蕩培16-18h，觀察菌落形態(tài)。然后配合顯微鏡形態(tài)觀察，根據(jù)結(jié)果來判斷能否進(jìn)行下一步。



2.污染的檢測和判別

①顯微鏡檢查

⑴取樣：用無菌操作方式取發(fā)酵液少許,涂布在載玻片上;

⑵制片、染色：自然風(fēng)干后,用番紅染液染色1-2min，水洗;

⑶干燥后用油鏡下觀察。



②平板檢查

⑴配制營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，滅菌，倒平板;

⑵取少量待檢發(fā)酵液經(jīng)稀釋 (大約10–6-10–7) 后涂布在營養(yǎng)瓊脂平板上，在37℃下培養(yǎng)24h;

⑶觀察菌落形態(tài)。



③肉湯培養(yǎng)檢查法(用于檢測培養(yǎng)基滅菌是否*)

將1ml待測液(滅菌處理后的種子培養(yǎng)基)接入葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基中，于37℃下培養(yǎng)24h，觀察培養(yǎng)基的狀態(tài)和顏色。


二、實(shí)驗(yàn)器材與試劑



1.器材

高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺、帶搖床的培養(yǎng)箱、顯微鏡、天平、三角瓶、試管、移液管、培養(yǎng)皿、 接種針、平板涂布器、酒精燈、載玻片



2.試劑

營養(yǎng)瓊脂、葡萄糖、磷酸二氫氨、七水合硫酸鎂、氯化鈉、磷酸氫二鉀、牛-肉膏、蛋白胨、0.4%酚紅溶液、蒸餾水、番紅染液、香柏油、擦鏡液



3.培養(yǎng)基

(1)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：直接稱量營養(yǎng)瓊脂粉4.5g，溶于100mL蒸餾水配制，pH 7.2，分裝到試管中，滅菌后擺成斜面。

(2)種子培養(yǎng)基：葡萄糖0.5%、磷酸二氫氨0.1%、七水合硫酸鎂 0.02%、氯化鈉0.5%、磷酸氫二鉀0.1%

(3)葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基：牛-肉-膏0.3%、蛋白胨0.8%、葡萄糖 0.5%、氯化鈉0.5%、0.4% 酚紅溶液，pH 7.2




三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果



1.種子的擴(kuò)大培養(yǎng)

觀察到在活化培養(yǎng)基上長出大量菌落，且菌落顏色單一，均為淡黃色。挑取邊緣菌落及形態(tài)一致的菌落少量，制作裝片，染色后在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)多個視野中都為桿菌，可初步得出活化的菌種中沒有污染雜菌。挑取沒有污染雜菌的菌落，用無菌操作技術(shù)接種，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。在適宜條件下培養(yǎng)18h后，得到了大腸桿菌的種子液，吸取該種子液在顯微鏡下觀察到有大量的大腸桿菌。



2.顯微鏡檢查

鏡檢時，多個視野中均觀察到的均為桿菌，呈鏈狀或單個存在，沒有觀察到球菌或其它形態(tài)的的細(xì)菌，因此可初步認(rèn)為該種子液中沒有雜菌污染。



3.平板檢查

從營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上觀察到菌落的形態(tài)為圓形、邊緣整齊、表面光滑、半透明或乳白色、菌落上有小的突起，這是典型的大腸桿菌菌落，沒有觀察到其它形態(tài)的菌落，因此可初步認(rèn)為該種子液中沒有雜菌污染。



4.肉湯檢測培養(yǎng)基滅菌是否*

葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基中有酚紅染液，酚紅在酸性環(huán)境中呈黃色，堿性環(huán)境中呈紅色。肉湯培養(yǎng)基中接種的待測液若有菌體存在，則菌體代謝會使培養(yǎng)基呈酸性，顯示黃色。該肉湯培養(yǎng)基經(jīng)培養(yǎng)后，仍呈現(xiàn)紅色，沒有變?yōu)辄S色，且澄清，未渾濁，說明待測液中沒有菌體存在，，因此，所測的滅菌種子培養(yǎng)基中沒有被菌體污染。



四、實(shí)驗(yàn)討論



1.在種子的擴(kuò)大培養(yǎng)前要對菌種進(jìn)行活化培養(yǎng)以獲得有活性的種子，若菌種已活化則可省略這一步。種子擴(kuò)大培養(yǎng)時，如果低溫保藏的菌種污染了雜菌，則應(yīng)棄去或用平板培養(yǎng)基純化后再用來活化和擴(kuò)大培養(yǎng)。



2.采用顯微鏡檢查法，如果從視野中發(fā)現(xiàn)有與目標(biāo)菌株不同形態(tài)的菌體則可認(rèn)為是污染了雜菌，該法簡便、快速，能及時檢查出雜菌。但是也有其不足之處：①對含雜菌少的樣品不易得出正確的結(jié)論，故應(yīng)多檢查幾個視野;②由于菌體較小，本身又處于非同步狀態(tài)，應(yīng)注意不同生理狀態(tài)下目標(biāo)菌與雜菌的區(qū)別，必要時可用革蘭染色、芽孢染色等輔助方法鑒別;③對固形物多的發(fā)酵液檢查較困難。



3.可以用發(fā)酵參數(shù)判斷法來檢測是否有雜菌污染。即在發(fā)酵過程中，以發(fā)酵時間為橫坐標(biāo)，以溶解氧或排氣中二氧化碳含量或發(fā)酵液的pH為縱坐標(biāo)，作曲線，若在工藝不變的情況下這些特征性曲線發(fā)生變化，則很可能是污染了雜菌。但是，發(fā)酵參數(shù)判斷法很難檢查出早期的污染菌。



4.肉湯培養(yǎng)檢查法只能用來檢測培養(yǎng)基的滅菌是否*，不適用于發(fā)酵液的檢查。



5.采用平板檢查法，若出現(xiàn)與目標(biāo)菌株形態(tài)不一的菌落，就表明可能被雜菌污染;若要進(jìn)一步確證，可配合顯微鏡形態(tài)觀察，若個體形態(tài)與菌落形態(tài)都與目標(biāo)菌相異，則可確認(rèn)污染了雜菌。此法適于固形物較多的發(fā)酵液檢測，形象直觀，肉眼可辨，不需儀器。但需嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作技術(shù)，所需時間較長，而且無法區(qū)分形態(tài)與目標(biāo)菌相似的雜菌。在污染初期，目標(biāo)菌占絕大部分，污染菌數(shù)量很少，所以要做比較多的平行試驗(yàn)才能檢出污染菌。